Forschungsprojekt: Nachweis bekannter Anwendungen der CRISPR/Cas-Technologie bei gentechnisch veränderten Organismen
Kurzbeschreibung
Lange Zeit war die Mutagenese im Erbgut von Organismen nur durch ungerichtete Methoden wie z. B. durch den Einsatz chemischer Stoffe oder ionisierender Strahlen möglich. Zwar konnten somit Genome verändert werden, allerdings konnten sowohl die Art der genetischen Veränderung als auch der Ort im Genom, an dem diese Veränderung stattfindet, nur marginal beeinflusst werden. Durch die neuen molekularbiologischen Techniken, die unter dem Begriff „Genome Editing“ zusammengefasst werden, hat sich dies grundlegend geändert. Modifikationen können nun gezielt und ortsspezifisch in das Genom verschiedenster Organismen eingeführt werden. Für diese Anwendungen werden vor allem Zink-Finger-Nukleasen (ZFN), transcription activator-like effector Nukleasen (TALEN), Meganukleasen und seit einigen Jahren auch das CRISPR/Cas-System verwendet. Die Gemeinsamkeit aller gerade aufgezählten Technologien liegt darin, dass sie auf programmierbaren Nukleasen basieren, welche an einer vom Nutzer definierten Stelle im Genom einen Doppelstrangbruch im Erbgut erzeugen können. Eine weitere Gemeinsamkeit dieser Techniken ist, dass nach der Erzeugung dieses Doppelstrangbruches der zelleigene Mechanismus zur Reparatur dieses Bruches genutzt wird, um unterschiedliche Arten von Modifikationen in das Erbgut einzubringen. Basierend auf der Art, wie dieser Reparaturmechanismus genutzt wird, lassen sich folgende drei Gruppen von Techniken definieren:
Site-Directed Nucleases-1 (SDN-1):
Der Doppelstrangbruch wird durch den zellinternen Reparaturmechanismus repariert, wodurch es zu einem Basenaustausch oder zu einer kleinen Insertion bzw. Deletion (InDel) von einzelnen Basenpaaren kommen kann. Dieser Mechanismus wird als Non-Homologous End Joining (NHEJ) bezeichnet.
Site-Directed Nucleases-2 (SDN-2):
Gibt man zusätzlich ein DNA-Fragment mit einer kleinen, vorab festgelegten Mutation zum Reaktionsansatz hinzu, wird dieses DNA-Fragment vom zellinternen Reparaturmechanismus als Vorlage für die Reparatur des Doppelstrangbruchs genutzt und die gewünschte Mutation in das Genom eingebaut. Dieser Mechanismus wird als Homology-Directed Repair (HDR) bezeichnet.
Site-Directed Nucleases-3 (SDN-3):
Um größere DNA-Fragmente in das Genom ortsspezifisch zu integrieren, werden DNA- Fragmente zum Reaktionsansatz hinzugefügt, die eine Fremd-DNA enthalten. Diese Fremd-DNA ist flankiert von DNA-Abschnitten, die zur DNA im Bereich des Doppelstrangbruchs identisch sind. Auch hier nutzt der zellinterne Reparaturmechanismus das hinzugefügte DNA-Fragment als Vorlage für die Reparatur des Doppelstrangbruchs, wodurch auch die Fremd-DNA in das Genom integriert wird (Transgen-Insertion).
Im Rahmen des vorliegenden Projekts sollten spezifische Nachweismethoden für Punktmutationen und InDels entwickelt werden, von denen bekannt ist, dass sie unter Zuhilfenahme der CRISPR/Cas -Technologie erzeugt wurden. Die Nachweismethoden sollten in verschiedenen gentechnisch veränderten Organismen (GVO) wie Viren, Bakterien oder eukaryotischen Zellen angewendet werden. Bei einem Vergleich dieser Methoden spielt neben der Spezifität und Sensitivität auch die Anwendbarkeit der Methoden für Routineanalysen im Rahmen der Überwachung gentechnischer Anlagen eine essenzielle Rolle.>-Technologie erzeugt wurden. Die Nachweismethoden sollten in verschiedenen gentechnisch veränderten Organismen (GVO) wie Viren, Bakterien oder eukaryotischen Zellen angewendet werden. Bei einem Vergleich dieser Methoden spielt neben der Spezifität und Sensitivität auch die Anwendbarkeit der Methoden für Routineanalysen im Rahmen der Überwachung gentechnischer Anlagen eine essenzielle Rolle.
Laufzeit: 01.12.2019-31.07.2021
Finanzielle Förderung: Dieses Forschungsprojekt wird durch das Bayerische Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz (StMUV) gefördert.
Publikationen:
- Mese K, Bunz O, Schellhorn S, Volkwein W, Jung D, Gao J, Zhang W, Baiker A, Ehrhardt A. 2020. Identification of novel human adenovirus candidates using the coxsackievirus and adenovirus receptor for cell entry. Virology Journal 17:52
- Mautner L, Baillie C-K, Herold HM, Volkwein W, Guertler P, Eberle U, Ackermann N, Sing A, Pavlovic M, Goerlich O, Busch U, Wassill L, Huber I, Baiker A. 2020. Rapid point-of-care detection of SARS-CoV-2 using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Virology Journal 17:160.
- Mese K, Bunz O, Volkwein W, Vemulapalli SPB, Zhang W, Schellhorn S, Heenemann K, Rueckner A, Sing A, Vahlenkamp TW, Severing A-L, Gao J, Aydin M, Jung D, Bachmann HS, Zänker KS, Busch U, Baiker A, Ehrhardt A. 2021. Enhanced Antiviral Function of Magnesium Choride-Modified Heparin on a Broad Spectrum of Viruses. International Journal of Molecular Sciences 22: 10075.
- Volkwein W, Pavlovic M, Anton M, Haase M, Stellberger T, Jarrar A, Busch U, Baiker A. 2021. Detection and Differentiation of Murine Leukemia Virus (MLV) und Murine Stem Cell
Virus (MSCV) and therefrom Derived Nucleic Acids. Journal of Virological Methods 299: 114316: