Forschungsprojekt:Untersuchungen zur subklinische Evidenz von Bluetongue Virus mit Impferfolgsprüfung und ovinem Herpesvirus 2 (BKF) mit Schwerpunktkontrolle bei Rind und Schaf in Mischbetrieben in Bayern "BT-BKF"
Kurzbeschreibung
Humorale und zelluläre Immunreaktionen nach der Impfung gegen BTV-8 bei Schafen und Rindern in ausgewählten Betrieben in Bayern
Ziele dieser Studie waren die Feststellung der Herdenprävalenz von BTV-8 Infektionen in ausgewählten bayerischen Schaf- und Rinderbeständen und die Prüfung der humoralen und zellulären Immunantwort von Schaf und Rind nach Impfung mit den Impfstoffen BLUEVAC-8, BTVPUR AlSap 8 und Bovilis BTV-8 im Rahmen der gesetzlich angeordneten Impfungen 2008 und 2009. Des Weiteren wurde die Unschädlichkeit des Impfstoffes BLUEVAC-8 bei nicht durch den Hersteller vorgesehenen Applikationsarten beim Schaf (i.v. und i.m.) getestet. Die Nachweisbarkeit des Impfvirusgenoms im Tier wurde im Blut der i.v. und i.m. geimpften Schafen untersucht. Zudem wurde der Effekt der Erhöhung der vorgeschriebenen Impfstoffdosis von BTVPUR AlSap 8 auf die Immunantwort des Rindes geprüft. Die Wirkung der Wiederholung der Impfung bei Schafen wurde während insgesamt viermaliger Impfstoffapplikation untersucht. Zusätzlich wurden Immunreaktionen von Tieren, welche vor der Impfung bereits natürlich mit BTV-8 infiziert worden waren, evaluiert.
Material und Methoden
Die Herdenprävalenz von BTV-8 bei Schafen und Rindern wurde anhand eines cELISA Testkits und einer RT-qPCR untersucht. Nach der Impfung der Tiere gegen BTV-8 wurde die Wirkung derselben anhand der ELISA-Antikörpertiter und der Bildung neutralisierender Antikörper gegen BTV-8, sowie gegen BTV-1, -2, -4 und -16 (Kreuzneutralisation) gemessen. Außerdem wurde die Fähigkeit zur Induktion zellulärer Immunreaktionen, messbar an Hand der Interferon-gamma Sekretion bei in vitro Restimulation von peripheren mononukleären Blutzellen mit BTV-8 und BTV-1 (IFN-? ELISPOT), untersucht. Die Prüfung zur Unschädlichkeit bei Vakzine-Fehlapplikation wurde anhand klinischer Symptome durchgeführt und die Antikörpertiter der Tiere mittels cELISA und SNT verfolgt. Der Nachweis des Impfvirusgenoms im Blut der Schafe, denen der Impfstoff i.v. und i.m. appliziert wurde, wurde anhand einer RT-qPCR geführt. Die Auswirkung von Wiederholungen der Impfstoffapplikation bei Schafen wurde ebenfalls anhand cELISA, SNT und IFN-? ELISPOT untersucht. Dieselben Tests fanden Anwendung bei der Untersuchung der Immunreaktionen von natürlich infizierten Rindern.
Ergebnisse
Bei neun Tieren aus den ausgewählten Betrieben konnten BTV-spezifische Antikörper und bei 15 Rindern aus der Routinediagnostik des LGL konnte BTV-8 Genom nachgewiesen werden. Die Impfwirksamkeitskontrolle ergab höchste gemessene ELISA-Ak-Titer im Median von 1:16 bei Rindern und von 1:2 bei Schafen im ersten Jahr der Impfung. Im zweiten Jahr der Impfung lagen die Titer deutlich höher, nämlich bei Rindern im Median bei 1:32 und bei Schafen bei 1:23. Neutralisierende Antikörper konnten bei Rindern und Schafen in den meisten untersuchten Betrieben erst nach der Impfung im zweiten Jahr nachgewiesen werden. Ausnahmen bildeten einige wenige Rinder, die nach dem Boost im Median einen SNT-Titer von 1:23 aufwiesen. Eine Kreuzneutralisation der Serotypen BTV-1, -2, -4 und -16 durch Serumantikörper der Tiere mit den höchsten ELISA-Ak-Titern erfolgte nur gegen BTV- 1 bei allen Tieren mit Titern zwischen 1:2 und 1:22. PBMC der untersuchten Tiere reagierten zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Probennahme verschieden stark auf eine Lektinstimulation (Con A, Positivkontrolle), auf die Restimulation mit BTV-8 und die heterologe Stimulation mit BTV-1. Im ELISPOT bilden PBMC einiger Tieremehr IFN-? spezifische Spots nach der homologen Restimulation mit BTV-8, andere reagierten stärker auf den BTV-1 Stimulus. Eine BTV Serotyp übergreifende zelluläre Reaktion konnte mit diesen beiden Serotypen ebenso wie die kreuzneutralisierende Wirkung der Antikörper nachgewiesen werden. Die intramuskuläre und intravenöse Fehlapplikation des Impfstoffes beim Schaf führte weder zu einem Nachweis von Impfvirusgenom im Blut noch zu Nebenwirkungen. Nach intramuskulärer Applikation war eine signifikant höhere optische Dichte im Ak-ELISA messbar als nach subkutaner Applikation. Bei den Rindern, denen eine vierfache Impfdosis BTVPUR AlSap 8 verabreicht wurde, konnten sowohl im Ak-ELISA als auch im SNT signifikant höhere Titer nachgewiesen werden als bei Rindern, die die vorgeschriebene einfache Impfdosis erhalten hatten. Eine Mehrfachimpfung bei Schafen wirkte sich durch höhere Serum-Ak-Titer im ELISA aus, die länger auf dem höheren Niveau bestehen blieben. Nach der vierten Impfstoffapplikation mit einem neu hinzugekommenen Impfstoff war der Titer mit 1:32 im Median am höchsten. Neutralisierende Antikörper gegen BTV-8 waren wiederum erst nach der vierten Impfung bei allen Schafen nachweisbar. Natürlich infizierte Rinder, die entweder durch vorhandene ELISA-Ak oder BTV-8 Genomnachweis im Blut identifiziert wurden, wiesen Antikörpertiter zwischen 1:1 und 1:256 vor der Impfung auf. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung lagen die Titer bei diesen Tieren zwischen 1:16 und 1:256. Virus neutralisierende Serumantikörper waren bei allen natürlich infizierten Tieren nachweisbar mit Titern zwischen 1:8 und 1:512.
Schlussfolgerungen
Die Grundimmunisierung führt bei Schafen und Rindern zu vergleichsweise niedrigen Antikörpertitern im cELISA, und nicht nachweisbaren Titern im SNT. Die Applikation des Impfstoffes i.m. oder auch die Erhöhung der Dosis führten zu einer Erhöhung der ELISA-Ak- Titer; Nebenwirkungen waren bei den entsprechend geimpften Tieren nicht feststellbar. Auch die Wiederholung der Impfung beim Schaf führte zu einer Erhöhung der ELISA-Ak-Titer. Neutralisierende Ak wurden bei den meisten Tieren erst nach der Impfung im zweiten Jahr mit dem Impfstoff BTV PUR AlSap 8 nachgewiesen. Eine zelluläre Immunreaktion, gemessen an der Interferon gamma (IFN-?) Sekretion nach in vitro Virus-Restimulation von mononukleären Blutzellen (PBMC), wurde in dieser Arbeit erstmals bei Tieren im Feld bestimmt. Die Untersuchungsergebnisse zur zellulären Immunreaktion gegen BTV mit selektierten und limitierten Blutproben sind ein erster experimenteller Ansatz zur weiteren Evaluation von zellulären Immunreaktionen nach der BTV-Impfung von Rind und Schaf. Sowohl bei Prüfung der humoralen (Antikörper), als auch der zellulären (IFN-g Sekretion) Reaktionen war eine Kreuzreaktivität der Seren und PBMC von BTV-8 geimpften Tieren mit dem BTV-1 Serotyp feststellbar, was auf eine engere Antigenverwandtschaft der beiden Serotypen BTV-8 und BTV-1 hinweist.
Laufzeit: 2008-2011