Forschungsprojekt: Etablierung und Validierung einer hochempfindlichen Analysenmethode zur routinemäßigen Bestimmung von Typ A Trichothecenen in Getreide und Getreideprodukten mittels LC-MS/MS
Kurzbeschreibung:
Im Rahmen dieses Projekts wurde eine hochsensitive LC-MS/MS Multimethode zum Nachweis von Typ A und Typ B Trichothecenen entwickelt und Daten zum Vorkommen dieser Mykotoxine in Getreide und Getreideprodukten des bayerischen Marktes ermittelt.
Während die Situation bei Deoxynivalenol (DON), dem bekanntesten Vertreter der Typ B Trichothecene, hinreichend bekannt ist, fehlen nach wie vor entsprechend repräsentative Daten und ausreichend sensitive Methoden für Typ A Trichothecene. Seitens der EU wurden daher dringend mehr Daten zum Vorkommen dieser Toxine vor allem in Hafer gefordert, auf deren Grundlage gegebenenfalls ein Grenzwert für T-2/HT-2 bis zum 1. Juli 2008 festgelegt werden soll (Verordnung (EG) 1881/2006). Die etablierte LC-MS/MS Multimethode ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung von 8 Typ A Trichothecenen (T-2 und HT-2 Toxin, T-2 Triol, 15-Monoacetoxyscirpenol, 4,15- Diacetoxyscirpenol, Neosolaniol, 4,15-Diacetylverrucarol und Verrucarol) sowie 5 Typ B Trichothecenen (Deoxynivalenol, 3-Acetyl-Deoxynivalenol, 15-Acetyl- Deoxynivalenol, Nivalenol und Fusarenon X) in Getreide und Getreideprodukten. Lediglich T-2 Tetraol wurde in einer Einzelmethode gemessen, da durch dessen Ähnlichkeit zu Nivalenol (NIV) keine chromatographische Trennung der beiden nur unterschiedlich zu ionisierenden Substanzen erreicht werden konnte. Die Proben wurden mit einem Acetonitril/Wasser-Gemisch (84/16, v/v) extrahiert und über MycoSep®-Säulen gereinigt. Ein Aliquot des Filtrats wurde unter Stickstoff bis zur Trockene eingeengt und die Rückstände für die anschließende LC-MS Messung in Fließmittel gelöst. Deutliche Matrixeffekte gegenüber Deoxynivalenol, wo Signalsuppressionen um bis zu 80 % beobachtet wurden, und gegenüber T-2 Toxin wurden durch die Verwendung neuerdings verfügbarer 13C-Stabilisotopenstandards korrigiert. In Abhängigkeit von der Matrix und den untersuchten Analyten schwankten die mittleren Wiederfindungsraten der Methode zwischen 60 % und 108 % mit relativen Standardabweichungen zwischen 0,5 % und 9,9 %. Die nach dem Signal/Rausch-Verhältnis ermittelten Nachweisgrenzen (LOD) des Verfahrens lagen zwischen 0,02 ?g/kg für 15-Monoacetoxyscirpenol (MAS) und 1,3 ?g/kg für NIV. Damit steht eine hochsensitive LC-MS/MS Multimethode für die Messung der Trichothecenbelastung unterschiedlicher Getreideproben zur Verfügung.
Mit der oben beschriebenen Methode wurden insgesamt 423 Proben untersucht, darunter 289 entsprechend Verordnung (EG) 401/2006 repräsentativ gezogene Proben, die zwischen Februar und Dezember 2006 aus bayerischen Mühlen und Lagerstätten, bei Direktvermarktern sowie in Lebensmittelzentrallager und im Einzelhandel entnommen wurden (98 Haferproben, 130 Weizenproben, 61 Roggenproben) sowie 117 nicht repräsentative Einzelhandelsproben und 17 Futtermittelproben aus der amtlichen Futtermittelüberwachung.
In repräsentativen Haferproben lag die Kontaminationsrate von T-2 und HT-2 bei 100 bzw. 99 % (Nachweisgrenze 0,04 bzw. 0,08 ?g/kg). Die mittlere Belastung mit T-2 und HT-2 in der Summe lag bei 15 ?g/kg (Median 8,2 ?g/kg) mit einem Höchstwert von 85 ?g/kg. Auffällig war, dass bei einer Inzidenz von 90 % und einer mittleren Belastung von 9,7 ?g/kg ähnlich hohe Konzentrationen für T-2 Tetraol nachgewiesen wurden, ein Typ A Trichothecen, zu dessen Vorkommen bisher wenig bekannt war (Median 6,4 ?g/kg, Höchstwert 85 ?g/kg). Bei Betrachtung einzelner Haferprodukte fielen Unterschiede in der Höhe der Belastung auf. Zarte Haferflocken waren am stärksten mit T-2/HT-2 belastet (Mittelwert 21 ?g/kg, Median 12 ?g/kg). Weitere Typ A Trichothecene wie Neosolaniol (NEO) und 15-Monoacetoxyscirpenol (MAS) wurden in über 90 % und T-2 Triol und Diacetoxyscirpenol (DAS) in 60 % der Proben gefunden, allerdings mit mittleren Gehalten unter 0,5 ?g/kg. DON wurde in 74 % der Haferproben mit einem Mittelwert von 2,8 ?g/kg nachgewiesen. Der Medianwert lag bei 0,5 ?g/kg. Die mittleren Belastungen mit Fusarenon X (FX), Nivalenol (NIV) und den Acetylderivaten von DON lagen alle unter 1 ?g/kg. Damit kann insgesamt von geringen Typ B Trichothecen-Gehalten in Hafer ausgegangen werden. Außerdem wurde der Einfluss der landwirtschaftlichen Erzeugungsweise auf die Toxinkonzentrationen untersucht. Es wurden signifikant geringere Toxinkonzentrationen für T-2, HT-2, T-2 Tetraol, T-2 Triol und NEO (P<0,001) sowie für DON (P=0,037) in ökologisch erzeugten Haferproben (n=51) gegenüber konventionellen (n=47) festgestellt.
Weizen war erwartungsgemäß deutlich höher mit Typ B Trichothecenen belastet. Die Kontaminationsrate mit DON lag bei 100 % (LOD=0,04 ?g/kg). Die Werte lagen im Bereich von 0,06 bis 1160 ?g/kg mit einem Mittelwert von 57 ?g/kg und einem Median bei 23 ?g/kg. Besonders belastet waren hierbei Weizenkleien. Die Kontaminationsraten von 3-Acetyl-DON (3-acDON) oder 15-Acetyl-DON (15-acDON) lagen bei über 50 bzw. über 70 %. Deren mittlere Belastung war mit unter 1 ?g/kg sehr niedrig. FX wurde in nur 5 % der Proben in Spuren nachgewiesen. NIV hingegen wurde in 67 % der Proben im Bereich zwischen der Nachweisgrenze und 96 ?g/kg nachgewiesen. T-2/HT-2 sowie T-2 Tetraol konnten – wenn auch in geringeren Konzentrationen – in 94 % bzw. in 53 % der Weizenproben gemessen werden. Die Werte lagen im Mittel bei 1,8 bzw. 2,6 ?g/kg mit Höchstwerten von 24 bzw. 83 ?g/kg in Weizenkleie. Die anderen Typ A Trichothecene wurden in deutlich weniger Proben bzw. in sehr niedrigen Mengen nachgewiesen. Bio-Produkte (n=42) waren wiederum geringer mit den meisten Toxinen belastet als konventionelle (n=88). Statistisch signifikant war dies für 3-acDON (P=0,015) und 15-acDON (P=0,006).
Roggen und Roggenprodukte waren zu 95 % mit T-2/HT-2 und zu 79 % mit T-2 Tetraol kontaminiert. Die mittlere Belastung lag bei 0,69 bzw. 2,3 ?g/kg mit Maximalwerten von 3,1 bzw. 8,1 ?g/kg. Andere Typ A Trichothecene wurden nur in sehr niedrigen Mengen nachgewiesen. DON hingegen war in allen Proben in Mengen zwischen 1,1 und 288 ?g/kg mit einem Mittelwert bei 28 ?g/kg und einem Median bei 15 ?g/kg nachweisbar. Beim Vergleich unterschiedlicher Produktgruppen stellte sich jedoch keine als besonders belastet heraus. Die Kontaminationsraten von 3-acDON und 15-acDON lagen bei 59 bzw. 80 % und die Mittelwerte in beiden Fällen unter 1 ?g/kg. Es wurden Höchstwerte von 5,0 bzw. 8,6 ?g/kg gemessen. NIV und FX waren in nur 3 % der Proben zu finden. Bei 32 Roggenproben handelte es sich um ökologisch erzeugte Produkte. Diese wiesen signifikant niedrigere Gehalte an T-2 (P=0,046), HT-2 Toxin (P=0,034), T-2 Tetraol (P<0,001) und DON (P=0,007) auf als konventionell erzeugte Roggenprodukte (n=29).
Unter den untersuchten Proben waren auch 19 Kleinkindernahrungen (diverse Getreidebreie in Pulverform). Eine T-2 oder HT-2 Belastung war in 89 % der Proben nachweisbar. Diese lag in der Summe im Mittel bei 5,6 ?g/kg bei einem Median von 4,8 ?g/kg und einem Höchstwert von 23 ?g/kg. Auffällig war zudem eine T-2 Tetraol-Kontamination mit einem Mittelwert von 8,0 ?g/kg (Median 0,15 ?g/kg) und einem Maximalwert von 85 ?g/kg. Mittlere DON-Gehalte lagen bei 4,1 ?g/kg (Median 1,1 ?g/kg). Die Typ A Trichothecene Diacetylverrucarol (DacVOL) und Verrucarol (VOL) wurden weder in Hafer noch in Roggen oder Weizen nachgewiesen. Stattdessen war die Kontamination mit T-2 Tetraol sehr auffällig, da sich diese sowohl in Hafer-, Weizen- und Roggenproben als auch in Kleinkindernahrung und in Futterhafer in der Größenordnung von T-2 oder HT-2 Toxin befand. Folglich ist die Gesamtbelastung mit Typ A Trichothecenen bei Berücksichtigung der T-2 Tetraol Gehalte zusätzlich zur T-2/HT-2-Belastung noch deutlich höher. Die anderen Typ A Trichothecene fielen dabei vergleichsweise wenig ins Gewicht.
Abschließend wurde anhand der erhaltenen Werte eine Risikobewertung für die Exposition von Kindern und Kleinkindern gegenüber T-2/HT-2 und DON durchgeführt. Die Ergebnisse wurden sowohl für ein „mean case-Szenario“ als auch für ein „bad case-Szenario“ berechnet (durchschnittliche Verzehrsmenge x Medianwert der Toxinbelastung / durchschnittliche Verzehrsmenge x 95 % Perzentilwert der Toxinbelastung). Obwohl die T-2/HT-2 Belastung von Hafer um ein Vielfaches höher war als die von Weizen, hat Weizen aufgrund seines mengenmäßig größeren Verzehrs einen deutlich höheren Anteil (mean case: 6,2 % / bad case: 43 %) an der Ausschöpfung der vorläufig tolerierbaren täglichen Aufnahmemenge (tTDI) als Hafer (2,8 % / 17 %). Der Gesamteintrag an T-2/HT-2 über den täglichen Weizen-, Roggen und Haferverzehr entsprach 9,7 bzw. 62 % des tTDI für T-2/HT-2. Auffällig waren die ermittelten Gehalte der untersuchten Kleinkindernahrungen. Die Bewertung ergab für 9 Monate alte Säuglinge bei durchschnittlichem täglichen Verzehr dieser Produkte eine T-2/HT-2 Exposition in Höhe von 27 % im mean case-Szenario bzw. 102 % des tTDI im bad case-Szenario. Für DON stellte Weizen wiederum die Haupteintragsquelle für die untersuchte Subpopulation dar (9,5 % / 67 % des TDI). Die DON-Aufnahme über Weizen, Roggen und Hafer zusammen belief sich auf 11 bzw. 75 % des TDI. In der Gruppe der Kleinkinder resultierte der Verzehr von Getreidebreien in maximal 5,4 % des TDI für DON.
Laufzeit: 2004 bis 2006.